ATN 224抑制剂SOD1活性

  ATN-224 是一种Cu2+/Zn2+-超氧化物歧化酶 1 (SOD1) 抑制剂。ATN-224 作用内皮细胞，抑制抑制SOD1活性，IC50 为 17.5±3.7 nM。

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  生物活性

  体外

  ATN-224对铜离子（10 8 mol / L -1）具有特异和高的亲和力，并且通过等温滴定量热法测定，在浓度高达1 mM时，对钙，铁，镁，锌或锰离子均无结合。ATN-224抑制两种HUVEC的增殖（IC 50 = 1.4±0.3μM； n = 5）。孵育24小时后，ATN-224还能够以0.33± 0.03μM的IC 50抑制纯化的牛SOD1的活性。ATN-224对SOD1的抑制作用与时间有关，在约16小时时达到大抑制作用。ATN-224似乎通过消耗铜的酶来抑制SOD1。ATN-224能够抑制内皮细胞中的SOD1活性，这种作用与IC 50呈剂量为17.5±3.7nM。ATN-224以剂量和时间方式抑制FGF-2诱导的ERK1 / 2磷酸化，IC 50在1.25至2.5μM之间，与抑制增殖的IC 50一致。ATN-224是一种可口服的无机小分子，可抑制内皮细胞和肿瘤细胞中的铜/锌酶超氧化物歧化酶1（Cu / Zn-SOD1）。

  体内

  当直接添加到Matrigel栓塞模型中或经口管饲时，ATN-224还显着（P <0.05）抑制了小鼠Matrigel栓塞模型中的血管生成。当通过管饲法给予ATN-224时，血管生成的抑制发生在血浆或来自Matrigel塞子的铜中可测量的铜耗尽之前。该结果表明ATN-224独立于铜耗竭而抑制血管生成。

  实验参考方法

  ATN-224的激酶测定

  将细胞以六孔形式铺板（每孔100-300,000），并与ATN-224以指定的浓度和指定的时间孵育。然后将细胞用10 ng / mL FGF-2刺激不同时间并裂解。使用对磷酸化p44 / 42丝裂原活化蛋白激酶具有特异性的抗体（Thr 202 / Tyr 204）对裂解液进行蛋白质印迹分析，并使用对p44 / 42丝裂原活化蛋白激酶具有特异性的抗体进行适当的信号校正。

  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

  ATN-224的细胞分析

  将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）保留在M200 / LSGS培养基中，并将细胞用于第2和第4代之间的所有实验。对于增殖测定，将细胞以每孔3,000的接种率接种在M200 / 2％FBS中的0.1％明胶上4小时，然后在存在或不存在ATN-224的情况下用2 ng / mL FGF-2刺激长达48小时。使用Alamar Blue或MTT测定法确定HUVEC增殖。多发性骨髓瘤MM1S细胞在含有10％胎牛血清和2 mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中生长。将HL-60早幼粒细胞白血病细胞和MOLT-4急性粒细胞白血病细胞以400,000 / mL接种在T-75烧瓶中，孵育48至96小时以进行增殖测定。使用钙黄绿素AM [1]测定MMS1细胞的增殖。

  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

  Animal Administration

  小鼠

  将冷基质胶（500μL）与800 ng / mL FGF-2或300 ng / mL VEGF和肝素（50μg/ mL）混合。阴性对照塞不含促血管生成因子。将基质胶混合物皮下注射到4至8周龄的雌性BALB / c裸鼠中。在某些实验中，分别将含或不含Mn-TBAP（100μM）的ATN-224（94μM）或水分别添加至组和阴性对照组的Matrigel栓塞中。另外，每天星期一至星期五，用蒸馏水或ATN-224进行管饲法小鼠。注射动物5天后处死动物并恢复栓子。然后将塞子切碎并用组织均质器均化，并使用Drabkin溶液确定塞子中的血红蛋白水平。

  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

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